Prokaryot ve ökaryot hücrelerin her ikisi de DNA'larını kopyalamak, yani replikasyon yapmak zorundadır, ancak bu süreci farklı şekillerde gerçekleştirirler. İlk önemli fark, DNA'nın yapısı ve bulunduğu yerdir. Prokaryotlarda (bakteri gibi) genetik materyal sitoplazmada bulunan, genellikle halka şeklinde tek bir DNA molekülüdür. Ökaryotlarda (insan veya bitki hücresi gibi) ise DNA, çekirdeğin içinde bulunur ve doğrusal (lineer) kromozomlar halindedir.
Replikasyonun başlama şekli de farklıdır. Prokaryotların halkasal DNA'sında genellikle tek bir replikasyon orijini, yani başlama noktası bulunur. Replikasyon buradan başlar ve çemberin etrafında iki zıt yönde ilerleyerek tamamlanır. Ökaryotların DNA'sı çok daha uzun olduğu için, kopyalama işlemini hızlandırmak amacıyla birden fazla (yüzlerce hatta binlerce) replikasyon orijini vardır. Replikasyon bu noktaların hepsinden aynı anda başlar.
Sürecin hızı ve kullanılan enzimler de değişiklik gösterir. Prokaryotlarda replikasyon çok hızlıdır, saniyede yüzlerce nükleotit ekleyebilirler. Bu işlemde DNA polimeraz III ana enzim olarak görev yapar. Ökaryotlarda ise replikasyon daha yavaştır; bunun bir nedeni de DNA'nın histon adı verilen proteinlere sıkıca sarılı (kromatin yapısı) olmasıdır ve bu yapının açılması gerekir. Ökaryotlarda DNA polimeraz $\delta$ (delta) ve $\epsilon$ (epsilon) gibi farklı polimeraz enzimleri ana kopyalama işini üstlenir.
Bir diğer temel fark, kromozom uçlarıyla ilgilidir. Ökaryotların doğrusal kromozomlarının uçlarında telomer adı verilen özel bölgeler bulunur. Her replikasyon döngüsünde bu uçlar biraz kısalır ve bu kısalmayı önlemek için telomeraz enzimi görev yapar. Prokaryotların DNA'sı halkasal olduğu için böyle bir uç sorunu ve telomeraz enzimine ihtiyaçları yoktur.
