Substrat düzeyinde fosforilasyon, reaktif bir ara üründen ADP’ye fosfat grubu aktarımı ile ATP’nin üretildiği bir kimyasal reaksiyondur. Bu olayda fosfat grubunu aktaran enzimlere fosfotransferaz denir.
Substrat düzeyinde fosforilasyon glikoliz ve Krebs döngüsü sırasında gerçekleşir. Glikolizde fosfogliserat kinaz ve pirüvat kinaz enzimleri substrat düzeyinde fosforilasyonu katalizler. Krebs döngüsünde ise sukcinil-CoA sentetaz enzimi substrat düzeyinde fosforilasyonu katalizler.
